タンパク質の化学修飾

タンパク質の化学修飾とは？

タンパク質の化学修飾とは「酵素や受容体などのタンパク質に化学反応により分子を導入したり部分構造を改変したりすること」です。

タンパク質の修飾は化学的手法以外に生物学的手法もあります。

1. 遺伝子の導入や酵素を用いるためこれらの制約を受ける（酵素の特異性、ミスフォールディング）
2. 非天然の構造の導入は難しい

化学的手法は意図した、狙った位置に選択的に修飾するのは難しく研究課題の一つとなっています。ですが、そのまま存在している天然のタンパク質を修飾するのは得意で自由度が高くコストや時間の面でも有利です。

タンパク質修飾の目的（化学的手法において）

タンパク質修飾は、タンパク質が本来持っていない機能の導入が目的です。

例えばタンパク質に蛍光の機能を持たせれば、細胞内のどこ（核周辺？ミトコンドリア？）にそのタンパク質があるか？を視覚的に捉えることが可能になりますし、蛍光強度によってタンパク質量を調べることも可能です。

化学修飾はタンパク質の機能を解明するのに役立ちます。

タンパク質修飾の種類を紹介

• アフィニティータグ(生物学的)
  • Hisタグ
  • GSTタグ
  • FLAGタグ
  • ビオチン
• 標識
  • Haloタグ（クロロアルカンとの結合）
  • 蛍光基
    • in vivoイメージング
  • 放射性同位体標識
  •  
• 機能性付与
  • PEG鎖
  • デリバリー・ターゲッティング （リガンドなどを付与）
    • 抗体ー薬物複合体
  • ブロッキング（活性中心のチオール、アミン、ヒドロキシ基などをブロック）

アフィニティータグ

アフィニティータグの多くは生物学的手法を用いて導入されたペプチドやたんぱく質です。

Waugh, David S. “Making the most of affinity tags.” Trends in biotechnology 23.6 (2005): 316-320.

Kimple, Michelle E., Allison L. Brill, and Renee L. Pasker. “Overview of affinity tags for protein purification.” Current protocols in protein science 73.1 (2013): 9-9.

Hisタグ

Hisタグは10個以下程度からなるポリヒスチジン鎖で構成されています。

Hisタグは数あるタグ分子のなかでもサイズが小さいため、導入による元のタンパク質への影響は小さいのが特徴です。

Hisタグ（ヒスチジンのイミダゾール）はニッケルなどの金属イオンに対して強い親和性があるため、主に金属アフィニティークロマトグラフィーを用いたタンパク質精製に用いられています。

Hisタグを用いた精製は有名ですがうまくいかないことも多く、特異性もあまり高くないです。Hisタグがタンパク質内部に埋もれてうまく吸着しない場合には変性条件で精製を行います。

GSTタグ

GSTはグルタチオン-s-トランスフェラーゼの略でタンパク質精製によく用いられます。

精製にはGSTのリガンドであるグルタチオンを用います。GSTーグルタチオン相互作用の特異性が高いため、高純度の高いタンパク質を得やすいです。

欠点はGSTが酵素であるため比較的大きく元のタンパク質の性質を変化させやすいことです。そのため場合によってはGSTタグの除去を行います。

FLAGタグ

FLAGタグはFLAGペプチド（DYKDDDDK）から構成されるもので、アフィニティ精製に用います。酵素であるGSTタグとは違って小さいペプチドであるため元のタンパク質への影響は小さいです。精製は抗FLAG抗体結合担体を用います。

標識（ラベル化）

タンパク質の生体内での動態、分布などを可視化する蛍光標識はラベル化の代表例です。

多くのラベル化剤は反応性の高い（求核性の高い）アミノ基やチオール基を標的としたものが多いです。

生体内には存在しないハロアルカン類と特異的に反応するHaloタグを導入し、Haloタグを起点として様々な機能性分子を導入するという手法も有名ですが、Haloタグをタンパク質にあらかじめ導入する必要があります。その点でタンパク質に事前に導入することなく標識できる化学的手法は有用です。

Haloタグ

Haloタグはハロアルカンデハロゲナーゼをタグとして導入することにより、ハロアルカンが結合した様々な機能性分子をエステル結合を介して導入することが可能なタグです。Haloタグ自体は生物学的に導入する必要がありますがが、Haloタグを起点に様々な分子が導入できるメリットがあります。

例えばアジドを導入することによりクリック反応に用いたり、切断可能な結合部位を有するハロアルカンビーズを用いてアフィニティ精製を行うなどの応用が可能です。

特にクリック反応は温和な条件下、水中で進行する数少ない有機化学反応ですが、生体に有毒な銅塩の添加が必要です。Bertozziらはシクロオクチンの環歪みを利用した銅塩を用いない方法を開発し、アジド化した糖タンパク質を生きた細胞に発現させて反応を行い蛍光ラベル化に成功しています。

Haloタグは強力な方法ですが，酵素という大きな分子をタンパク質に導入するため、元の機能が損なわれる可能性があるという欠点があります。

Los, Georgyi V., et al. “HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.” ACS chemical biology 3.6 (2008): 373-382.

PEG化

PEG(Poly ethylene glycol)鎖は溶解性の悪いタンパク質の溶解性を向上させる目的で導入されることが多いです。PEG化は古くから研究されていて、毒性も低いことが知られています。

現在上市されている医薬品にもPEG化された医薬品が販売されています。

• レブコビ筋注(PEG化ウシアデノシンデアミナーゼ類縁体)
• レフィキシア静注用(PEG化血液凝固第IX因子)
• ペガシス皮下注(PEG化インターフェロンα)

http://www.nihs.go.jp/dbcb/approved_biologicals.html

PEG鎖導入による効果

• 溶媒中への溶解性向上（水/有機溶媒両方）
• 抗原性の低下
• 安定性の向上（凝集抑制、熱安定性、耐酵素）
• 血中滞留時間の増加

Kumar, Vineet, Vikas K. Sharma, and Devendra S. Kalonia. “Effect of polyols on polyethylene glycol (PEG)-induced precipitation of proteins: Impact on solubility, stability and conformation.” International Journal of Pharmaceutics 366.1-2 (2009): 38-43.

小寺洋, and 稲田祐二. “ポリエチレングリコール (PEG)-タンパク質ハイブリッド.” 高分子論文集 48.5 (1991): 261-276.

化学修飾の課題

修飾による活性低下

活性中心への分子導入は本来の機能を損なう原因となりうる

酵素の活性中心近傍や受容体の結合部位など活性を示す部位を修飾してしまうと、本来もっている機能が失われる可能性があります。活性中心以外でも化学修飾の影響でタンパク質の立体構造に変化が起これば機能は失われてしまいます。

従って化学修飾ではタンパク質の機能を失わない部位選択的に修飾する方法を開発する必要があります。

そのため位置選択的な化学修飾法の研究が盛んに行われています。

活性低下に関わる課題

一般的な化学反応をそのままタンパク質の化学修飾に利用するのは難しいです。

• 水系・室温・中性の温和な化学反応条件
• 位置選択性
• 立体構造の保持

一般的な化学反応を行う環境・条件は有機溶媒を用いたり、酸・塩基、重金属を用いるためデリケートな生体やタンパク質にとっては厳しい環境です。また、特定の官能基ではなく特定の場所にある官能基のみと反応させるような位置選択性の制御は困難です。こうした課題を克服した方法であれば細胞などの生きたサンプルに対しても後から修飾を行うことができるため、生物学的手法に対するアドバンテージにもなります。

水中で進行する化学反応の開発、重金属を含まない有機分子触媒の開発、リガンドやタンパク質立体構造を利用した位置選択的な化学反応の開発などが研究されています。

可逆的な修飾

通常、タンパク質への分子導入は不可逆的な共有結合を介して行われます。

共有結合は強力な結合なため、後で切り離すといったことはできません。

導入した分子は少なからず元のタンパク質の性質に影響を与えるため、目的の機能を発揮したあとは機能性分子を取り外せる仕組みがあると便利です。

可逆的な結合を介して分子を導入する方法があれば任意のタイミングで修飾した分子を切り離すことができます。

特定の条件下で反応を制御できる可逆的な共有結合（イミン結合、ジスルフィド結合）の利用などが考えられます。

タンパク質を修飾する方法

遺伝子コードラベル化法 (生物学的方法)

遺伝子工学的な方法でタンパク質を導入する方法として最も有名なものは蛍光タンパク質の導入だと思います。

蛍光タンパク質は、遺伝子コードラベル化法といって目的のタンパク質をコードする遺伝子を細菌などに導入し，タンパク質を発現させて得る方法です。

GFPなどの蛍光タンパク質の導入は有用ですが、蛍光タンパク質というだけあってサイズが大きく元のタンパク質の性質を変化させてしまう可能性が高いです。

Haloタグのようにタンパク質を導入する方法以外にも非天然アミノ酸を取り込んで化学反応を行わせる方法も考案されています。この方法ではハロアリール、アジド、アルキン、テトラジンなどを導入することができます。

選択的な有機化学反応を用いる方法

事前に酵素やペプチドを導入することなく、天然のタンパク質が持つ標的アミノ酸に対して選択的な化学反応を起こすことによってタグを導入する方法が研究されています。

ラベル化の標的となるアミノ酸は反応性の高いアミノ基やチオール基を持つリシンやシステインが多いです。

反応剤となる分子は生体には存在しない試薬を利用することで選択性の向上が期待できます(生体直交性）

• ケトン
• アルキン・アルケン
• アジド

システイン残基に対する化学反応を用いた方法

システイン側鎖のチオールとチオエステルが反応し，アシル転移を経て進行するネイティブケミカルライゲーションはタンパク質合成にも使える信頼性の高い強力な方法です。N末端のシステインを標的としてアミドを形成します。

システイン残基に依存するため、システイン残基を持たないタンパク質には当然利用できず、システイン残基が多いタンパク質に対しても選択性が低下します。

一般的に後述するリシンと比べてシステインの存在比率は小さいため、高い選択性を得やすいです。チオール基のソフトな求核性はアミノ基やヒドロキシ基とは異なり、マレイミドなどの炭素求電子剤との反応性が高い点も選択性が向上するポイントの一つです。

チオール基のジスルフィド交換により導入する方法は他の求核性分子の影響を受けないため有用です。

リシン選択的な修飾

リシンは第一級アミノ基を持つアミノ酸で高い求核性があるため化学的修飾の標的となるアミノ酸です。リシンは生体にありふれたアミノ酸であるため、一般的に選択性を出すのは困難で、位置選択的に修飾するにはリガンドなどを用いて狙った反応点に反応試薬を近づけるなどの戦略が必要になります。

リジンは豊富に存在するため、選択性を考慮しない用途、あるいは複数の修飾が必要な場合に適しています。

よく利用されている反応剤はNHSエステル（スクシニジルエステル）等の活性エステル、アルデヒド体との還元的アミノ化反応、イソチオシアネートやイソシアネート使ったウレアの形成などの方法があります。

• 活性エステル法
• 還元的アミノ化
• イソシアネート/イソチオシアネート

リシンの一級アミノ基選択的な反応はこれまでに知られています。

HPLCのための蛍光誘導体化 – 基礎とアミン編

チロシン選択的な修飾

チロシンのフェノールも標的になります。チロシンもシステインと同様にリシンよりも存在量が少ないので選択性の面で有利です。

参考

Naowarojna, Nathchar, et al. “Chemical modifications of proteins and their applications in metalloenzyme studies.” Synthetic and systems biotechnology 6.1 (2021): 32-49.

Sakamoto, Seiji, and Itaru Hamachi. “Recent progress in chemical modification of proteins.” Analytical Sciences (2018): 18R003.

Spicer, Christopher D., and Benjamin G. Davis. “Selective chemical protein modification.” Nature communications 5.1 (2014): 1-14.

Boutureira, Omar, and Gonçalo JL Bernardes. “Advances in chemical protein modification.” Chemical reviews 115.5 (2015): 2174-2195.

治京玉記. “タンパク質の化学修飾法―最近の進歩―.” 中村学園大学薬膳科学研究所研究紀要 3 (2010): 7-32.