有機化学

カラムクロマトグラフィー 展開溶媒の検討のコツは?失敗しない方法

カラム展開溶媒

展開溶媒の検討はカラム成功の鍵

カラムの操作手順やコツなどは前回に述べました。カラムクロマトグラフィーを行うには展開溶媒が必要で、どんな展開溶媒でも良いというわけではなく、分離したい化合物が別々に回収できるような展開溶媒を選択しなければいけません。カラムの展開溶媒はTLCを使って決めます。カラムの展開方向は上から下、TLCは下から上で異なりますが、展開方向を合わせれば同じことです。TLCでRf値が高い化合物がカラムでは先に出てきます。

良い展開溶媒は分離したい化合物とスポットが重ならず、できるだけ離れる溶媒です。そして分離したいスポットのRf値が0.3くらいに来るように極性を調節します。手順は、

  1. 様々な展開溶媒の組み合わせを試してスポットができるだけ分離する展開溶媒をTLCで見つける
  2. 見つけた展開溶媒の極性を調節してRf=0.3くらいにもってくる。

のような手順で展開溶媒を決定します。1と2は同時にやってしまうことが多いです。

溶媒の選択性とは?色んな組み合わせを検討する意味

溶媒の種類が異なれば、化合物と溶媒の相互作用の仕方も異なります。同じ極性溶媒のメタノールとアセトニトリルとでは、メタノールはヒドロキシ基に由来するプロトンをもっていますが、アセトニトリルはもっていません。これによって水素結合の仕方が異なるので、展開の仕方もお互いに異なります。このように溶媒には選択性があります。

だから、TLCでは沢山の展開溶媒の組み合わせを検討しなさいと言われます。例えば、化合物AとBをジクロロメタン/メタノールの組み合わせをTLCで検討したら上からA,Bと展開されたが、ジクロロメタン/アセトにトリルの組み合わせとでは上からB,AとRf値が逆転することもあります。

選択性が似ている溶媒がある

メタノールとエタノールなどのように構造が似ているものは展開の仕方も似ています。したがって、ジクロロメタン/メタノールとジクロロメタン/エタノールを検討する必要はあまりないです。できれば、似ていない溶媒の組み合わせを試すべきです。溶媒の選択性をグループ分けすると

  1. ジエチルエーテル
  2. エタノール、メタノール、プロパノール
  3. THF
  4. ジクロロメタン
  5. 酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル
  6. トルエン
  7. クロロホルム
  8. ヘキサン(無極性グループ)

Lloyd R. Snyder, et al. Introduction to Modern Liquid Chromatography Third Edition, Wiley.より

となります。スポットが重なって分離できないというときは、試していないグループの溶媒があれば、選択性が異なるので分離できる可能性があります。同じグループ内で検討するよりも、別の番号グループとの組み合わせで検討しましょう。

同じグループ内では極性の違いで使い分けます。例えばトルエン/酢酸エチルでは酢酸エチルを100%にしてもスポットが上がらないという時、酢酸エチルよりも極性の高いアセトンやアセトニトリルを試します。

試したほうが良い溶媒は、THFやジエチルエーテル(MTBE,イソプロピルエーテル等)などエーテル系ですね。あまりTLCで検討しないひとが多いと思いますが選択性が結構違うので展開パターンが大きく変わる可能性があります。

Rf値とカラムの展開の仕方はどう変化する?

良い展開溶媒の組み合わせが見つかったら、混合比率を調整して目的の化合物がRf値0.3くらいになる溶媒を見つけます。別れにくい化合物の場合はRf値を下げるとカラム内に保持される時間が長くなり、分離しやすくなります。

カラムではカラムボリューム(CV)という考え方があります。カラムボリュームはRf値から変換可能で

CV=1/Rf

となります。Rf値=1の時 CV=1 Rf値=0.5→CV=2 Rf値0.1→CV=10です。CVが意味するのは、カラム体積(シリカゲルが詰まっている体積)で、Rf=1→CV=1の化合物はカラムの体積分のその展開溶媒流すと出てくるということを意味します。Rf=1ということはほとんどシリカに保持されずに出てくるので、体積分流したら出てくるということですね。

Rf値が0.5ならシリカ体積の2倍量の溶媒を流すと出てくるということです。このようにRf値をCVに変換すると直感的に化合物の挙動が想像しやすいのでよく使います。

分離したい化合物とのスポットは離れていたほうが分離しやすいですよね?これをCV値に変換すると少し印象が変わります。

  • 化合物AのRf値=0.8
  • 化合物BのRf値=0.5
  • ⊿(A-B)=0.3

のようにRf値の差は0.3です。では別条件にしたら

  • 化合物AのRf値=0.4
  • 化合物BのRf値=0.1
  • ⊿(A-B)=0.3

こちらもRf値の差は0.3です。これをCVに変換するとどうなるでしょうか?

  • 化合物AのRf値=0.8→CV値=1.25
  • 化合物BのRf値=0.5→CV値=2
  • ⊿(A-B)=0.75

⊿CV=0.75でした。では別条件では?

  • 化合物AのRf値=0.4→CV値=2.5
  • 化合物BのRf値=0.1→CV値=10
  • ⊿(A-B)=7.5

こちらの⊿CV=7.5で、十倍もこちらのほうが大きいです。これをカラムのイメージで捉えると最初の条件はAの化合物が出てきてから、シリカ体積0.75倍分の溶媒を流すとBが出てくる。

二番目の条件ではAの化合物が出てきてから、シリカ体積7.5倍分の溶媒を流すとBが出てくる。

どちらのほうがAとBが分けやすいでしょうか?圧倒的に二番目の条件が分けやすいですよね?最初の条件ではAが分けきる間にBが出てきてしまう可能性が高いです。

Rf値は低い部分での差のほうが、カラム上では大きく分離するというのが理解できたとおもいます。だからカラムの展開溶媒はRf値0.3以下に設定しろというのです。Rfが低ければいいのかというと、低すぎると沢山溶媒を使わないと出てこないので時間も溶媒も無駄になります。だから大きくRf値が離れていたりする場合は、Rf値0.3にこだわる必要はないのです。

カラムクロマトグラフィー全体の解説はこちらです

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こめやんは理学博士です!化学の面白さと学ぶメリットを少しでも伝えるために日々頑張ります! ツイッターにて疑問点や依頼などを募集しています! 論文の和訳やレポートのチェックなどでもお気軽にお待ちしております